細(xì)胞是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要材料，也是生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。藥物、基因功能、疾病機(jī)理等的相關(guān)研究多數(shù)需要在細(xì)胞水平進(jìn)行闡釋。在細(xì)胞培養(yǎng)和消化的操作過(guò)程中，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，因此每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能導(dǎo)致操作的失敗。以下是我們匯總了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞消化的小貼士，希望能給正操作細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞消化的研發(fā)人員帶來(lái)幫助。
細(xì)胞系身份需明確
之所以選定某種細(xì)胞系開展實(shí)驗(yàn)，是因?yàn)樗x細(xì)胞系的一些特性符合研究方向的設(shè)定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達(dá)特性等。一旦用錯(cuò)了細(xì)胞株，對(duì)研究結(jié)果的判斷就會(huì)帶來(lái)很大的誤差和不確定性。
而近年來(lái)，多個(gè)權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系在培養(yǎng)和流通過(guò)程中，出現(xiàn)了很嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，單就HeLa細(xì)胞系導(dǎo)致的污染致使3萬(wàn)多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性存在問(wèn)題（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而這種情況不僅僅限于HeLa細(xì)胞。多個(gè)權(quán)威機(jī)構(gòu)研究人員檢測(cè)發(fā)現(xiàn)超過(guò)451個(gè)細(xì)胞系已被其它細(xì)胞完全吸收，在所檢測(cè)細(xì)胞中污染占比46%，可見(jiàn)細(xì)胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍。因此，做實(shí)驗(yàn)前對(duì)細(xì)胞株驗(yàn)明正身非常重要。如果是在機(jī)構(gòu)購(gòu)買的細(xì)胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報(bào)告。
細(xì)胞培養(yǎng)和消化
細(xì)胞培養(yǎng)大致分為兩種，一種是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，一種是貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)論是哪種方式，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)一般會(huì)通過(guò)以下幾個(gè)步驟：
細(xì)胞準(zhǔn)備
↓
細(xì)胞傳代
↓
細(xì)胞培養(yǎng)基配置
↓
細(xì)胞接種
↓
培養(yǎng)條件控制
↓
細(xì)胞觀察和培養(yǎng)
↓
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
↓
細(xì)胞凍存
當(dāng)然以上只是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的一個(gè)基本框架，實(shí)際操作可能會(huì)因細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程而有所不同。
細(xì)胞消化是研發(fā)人員在操作細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一個(gè)步驟，一般細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%密度則需要傳代消化，貼壁細(xì)胞傳代前，需要把細(xì)胞用消化試劑從培養(yǎng)容器表面解離出來(lái)，細(xì)胞得以分離成單個(gè)懸液傳代至含新鮮培養(yǎng)基的新容器內(nèi)；常見(jiàn)的細(xì)胞消化方法有三種：酶消化法、離子螯合法、機(jī)械消化法。
其中，酶消化法是用得最多的，主要使用胰蛋白酶，一般濃度在0.25-0.5%，消化的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類、作用溫度等因素而變化。一般來(lái)說(shuō)，0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37℃條件下消化1-5分鐘就足夠了。需要注意的是，Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，因此不含Ca2+、Mg2+，含EDTA的胰酶活性更高; 最后，可用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化。
胰蛋白酶大致可以分為兩種，一種是傳統(tǒng)使用的動(dòng)物源性的胰蛋白酶，主要提取自?；蜇i的胰腺組織，其缺點(diǎn)是會(huì)帶來(lái)病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)；另一種則是非動(dòng)物源性胰酶，即利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的重組胰蛋白酶。重組胰蛋白酶具有許多潛在用途，包括用于生產(chǎn)藥品、用作研究工具以及生物技術(shù)應(yīng)用，例如蛋白類藥物的生產(chǎn)、細(xì)胞的分離、疫苗生產(chǎn)以及用于細(xì)胞分析的組織樣本的制備，同時(shí)解決了傳統(tǒng)使用的豬或牛胰蛋白酶可能帶來(lái)病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)2020版藥典第一次收錄了無(wú)動(dòng)物源性重組胰蛋白酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?？傮w而言，重組胰蛋白酶在生物藥及科研領(lǐng)域是不可缺少的工具酶。
重組胰蛋白酶在實(shí)際應(yīng)用中的使用步驟：
① 配制緩沖液：用滅菌水配制10L HBSS平衡鹽溶液。
HBSS平衡鹽溶液配方：400mg/L KCl，60mg/L KH2PO4，350mg/L NaHCO3，8000mg/L NaCl，121mg/L Na2HPO4·12H2O，1000mg/L葡萄糖。
② 取1g重組胰蛋白酶（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)），用HBSS平衡鹽溶液溶解澄清，使胰蛋白酶的酶活濃度為500USP units/ml-1500 USP units/ml，或者使胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.1mg/ml-0.3mg/ml。（500USP units/ml的濃度適合大部分細(xì)胞的消化，原代細(xì)胞、組織等可適當(dāng)提高濃度至1500 USP units/ml）
注意事項(xiàng)
1）冀百康生物重組胰蛋白酶消化液含有EDTA，應(yīng)注意其不同細(xì)胞的使用適配性。且本重組胰蛋白酶消化液不含抑菌劑，使用過(guò)程中要特別注意無(wú)菌操作，避免消化液被微生物污染。
2）建議將本重組胰蛋白酶消化液分裝為100ml/瓶，在-15~-20℃條件下存放，能穩(wěn)定存放12 個(gè)月。不宜 4℃長(zhǎng)期保存，切忌反復(fù)凍融造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì)。
常見(jiàn)問(wèn)題
Q1：什么是EDTA？為什么重組胰蛋白酶要加入EDTA？
EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。
Q2：如何控制胰酶消化時(shí)間？
不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì)有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲(chǔ)存時(shí)間，胰酶的儲(chǔ)存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)。消化對(duì)于新購(gòu)買的細(xì)胞，建議先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。
Q3: 培養(yǎng)基誤存于-20℃，溶解后繼續(xù)使用?
在-20℃下，培養(yǎng)基中的鹽容易析出，培養(yǎng)基再次融化后，有的鹽可能無(wú)法重新溶解，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和滲透壓改變，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，容易細(xì)胞破裂而死亡，建議丟棄該培養(yǎng)基,使用新的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。
Q4：消化過(guò)度的主要特征有哪些?
會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)一部分細(xì)胞損傷和死亡，剛傳代后的培養(yǎng)液表面漂浮細(xì)胞團(tuán)，肉眼可見(jiàn)漂著小片白色膜狀物。如果細(xì)胞團(tuán)中都是死細(xì)胞，則不會(huì)貼壁。如果細(xì)胞團(tuán)中仍存在有活力的細(xì)胞，就會(huì)貼壁造成局部細(xì)胞密度不均勻，該局部較快形成中央壞死細(xì)胞區(qū) 。
Q5：細(xì)胞消化不下來(lái)是什么情況?
(1)有些細(xì)胞貼壁比較牢，因此每次消化吹打之后總會(huì)剩下一些細(xì)胞，或者細(xì)胞長(zhǎng)得較好而培養(yǎng)瓶太久沒(méi)換，為了顧全大部分有活力的細(xì)胞，細(xì)胞消化要適可而止。(2)不同種類的細(xì)胞所需消化時(shí)間也不同。因?yàn)橘N壁細(xì)胞的消化一般在2分鐘左右，對(duì)于個(gè)別出現(xiàn)的細(xì)胞難以消化，經(jīng)過(guò)多次消化和反復(fù)吹打之后仍無(wú)效，就放棄吧。
*參考文獻(xiàn)：
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